Trong những năm gần đây, probiotic đã được áp dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm và dược phẩm nhờ những lợi ích sức khỏe mà nó mang lại. Nhiều chế phẩm probiotic thương mại hiện nay là thành viên của vi khuẩn axit lactic (LAB). Nhiều LAB quen thuộc và được công nhận an toàn thuộc chi Lactobacillus, thường được sử dụng trong quá trình lên men rau, trái cây và sữa. Lactobacillus cũng có mặt như một hệ vi sinh vật niêm mạc bình thường của người và động vật. Chúng chủ yếu là ưa thích hoặc kỵ khí, không gây bệnh và thích điều kiện có tính axit của đường tiêu hóa. Các nghiên cứu cho thấy tiêu thụ lợi khuẩn Lactobacillus giúp duy trì sức khỏe và ngăn ngừa nhiễm trùng đường ruột. Do đó, các loài Lactobacillus được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm probiotic bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus reuteri và Lactobacillus rhamnosus.

Trong các ứng dụng thực phẩm và dược phẩm, chế phẩm probiotic dạng bột vi khuẩn sẽ thuận tiện hơn trong vận chuyển và kết hợp vào các hoạt động chế biến khác như phối trộn và đóng viên. So với sản phẩm dạng lỏng, chế phẩm dạng bột có lợi thế trong việc duy trì hoạt động của các thành phần có hoạt tính sinh học, giúp kéo dài thời hạn sử dụng của sản phẩm. Tuy nhiên, hiệu suất sản xuất và mật số sống sót của LAB trong quá trình sấy khô bảo quản thường không cao nên giá thành sản xuất cao và thời gian bảo quản ngắn. Một nghiên cứu chứng tỏ khả năng sống sót của L. plantarum sau khi sấy phun chỉ khoảng 0,85%. Với các tỷ lệ sống sót sau sấy thấp, thời gian bảo quản ngắn nên sẽ đẩy giá thành lên rất cao làm hạn chế khả năng sử dụng của chế phẩm probiotic.

Sự sống sót của vi khuẩn probiotic trong quá trình sản xuất và sử dụng phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, chẳng hạn như lựa việc chọn chủng, điều kiện nuôi cấy, môi trường lên men, điều kiện sấy khô và lựa chọn chất nền thực phẩm để đảm bảo vi khuẩn sống sót đi đến đường ruột. Trạng thái sinh lý thích nghi với môi trường nuôi cấy cũng có thể là một yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của vi khuẩn probiotic. Chẳng hạn như cảm ứng thích nghi với các sốc môi trường có thể cải thiện khả năng chống lại quá trình lạnh đông và làm khô ở vi khuẩn. Để tạo ra phản ứng thích nghi của tế bào, người ta đã cố gắng nuôi cấy Lactobacillus trong các điều kiện dưới ngưỡng gây chết, bao gồm sử dụng nhiệt độ cao và thấp, sự thay đổi của pH, oxy và áp suất thẩm thấu, cũng như bổ sung các chất ức chế như muối mật.

Trong nghiên cứu này, để chứng minh sự thích nghi của LAB với sốc môi trường có thể cải thiện khả năng sống sót của tế bào trong quá trình sấy đông khô, chủng vi khuẩn L. plantarum VAL6 đã được nuôi cấy trong các điều kiện gây sốc môi trường khác nhau bao gồm nhiệt độ, pH và sự tăng nồng độ CO2. Cải thiện khả năng sống sót được đánh giá thông qua sự thay đổi mật số của vi khuẩn trong suốt quá trình gây sốc và tỷ lệ sống sót sau khi sấy đông khô. 

Vật liệu và phương pháp

Vật liệu

Chủng vi khuẩn L. plantarum VAL6 được cung cấp từ Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên thiên nhiên, Trường Đại học An Giang, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh. Thành phần môi trường Man Rogosa Sharpe (MRS) nuôi cấy vi khuẩn [14]: Yeast extract 2%; Peptone 1%; Glucose 2%; NaCl 0,5%; K2HPO4 0,2%; MgSO4 0,02%; MnSO4 0,004%; Tween 80 0,1%.

Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm gây sốc môi trường: các thí nghiệm gây sốc môi trường được thực hiện độc lập trong Bioreactor 5 l (BIOSTAT, Sartorius Stedim, Germany). Cụ thể, 5 l môi trường MRS được cấy với 100 ml dịch giống vi khuẩn (OD595=1,5). Thực hiện nuôi cấy ở điều kiện bình thường (pH=6,8, nhiệt độ 37°C và tốc độ khuấy được đặt ở 250 vòng/phút) khoảng 24 giờ. 

Để đánh giá ảnh hưởng của sốc pH lên khả năng sống sót của vi khuẩn, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường, các nuôi cấy được xử lý ở các pH bằng 2,5; 3; 3,5; 8; 8,5 và 9. Các mốc thời gian xử lý là 1, 3, 5 và 7 giờ.

Để đánh giá ảnh hưởng của sốc nhiệt lên khả năng sống sót của vi khuẩn, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường, các nuôi cấy được xử lý ở các nhiệt độ  15, 25, 42 và 47oC. Các mốc thời gian xử lý là 1, 3, 5 và 7 giờ.

Thí nghiệm tăng nồng độ CO2 được thực hiện ở giai đoạn đầu của nuôi cấy. Ngay sau khi chủng giống đầu tiên để nuôi cấy, CO2 được cung cấp liên tục với tốc độ 50 cm3/lít môi trường/phút. 

Kết quả thảo luận

Thay đổi mật số vi khuẩn dưới tác động của sốc môi trường 

Mật số L. plantarum VAL6 tương đối ổn định dưới tác động của sốc ở pH 3,5 và ở pH kiềm. Tuy nhiên, dưới tác động của pH thấp 2,5-3, mật số vi khuẩn giảm mạnh. Ở pH 2,5 và 3, mật số giảm nhanh sau 1 giờ gây sốc còn 6 và 6,8 LogCFU/ml và sau đó giảm nhẹ trong suốt thời gian xử lý. Ngược lại, sốc ở pH cao (pH 8-9) và ở pH 3,5, mật số L. plantarum VAL6 ít thay đổi trong suốt thời gian gây sốc 

Hình 2. Ảnh hưởng của sốc pH lên mật số L. plantarum VAL6.

Kết quả cho thấy mật số L. plantarum VAL6 ít thay đổi dưới điều kiện sốc nhiệt (hình 3). Ở điều kiện sốc 42oC, mật số L. plantarum VAL6 dao động khoảng 9,2 LogCFU/ml, khác biệt không có ý nghĩa (p>0.05) khi so sánh với đối chứng không gây sốc. Tuy nhiên, ở 47oC, mật số L. plantarum VAL6 giảm nhẹ và còn khoảng 8,38 LogCFU/ml sau 7 giờ gây sốc. Ở các điều kiện xử lý nhiệt độ thấp (15 và 25oC), mật số L. plantarum VAL6 bắt đầu giảm sau 1 giờ xử lý và dao động trong khoảng 8,5-8,7 LogCFU/ml trong suốt quá trình xử lý. 

Hình 3. Ảnh hưởng của sốc nhiệt lên mật số L. plantarum VAL6.
Không giống với những yếu tố gây sốc, sự tăng nồng độ CO2 lại kích thích làm tăng mật số L. plantarum VAL6 (hình 4). Dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2, mật số vi khuẩn dao động trong khoảng 9,2-9,4 Log CFU/ml, so với đi

ều kiện không gây sốc chỉ đạt khoảng 9 LogCFU/ml. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu không tìm thấy sự khác biệt (p>0,05) về mật số ở hai điều kiện xử lý CO2 trong 4 và 24 giờ.   

Hình 4. Mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2.

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các chủng probiotic Lactobacillus có khả năng đi qua dạ dày đến khu trú vào hệ đường ruột người và động vật, giúp tăng cường sức khỏe cho vật chủ. Để có hiệu quả trong sử dụng, vi khuẩn probiotic phải sống sót qua đường tiêu hóa và đến ruột non. Các vi khuẩn probiotic phải đối phó với môi trường thù địch trong suốt quá trình chúng đi qua đường tiêu hóa [18]. Do đó, việc xác định khả năng chịu đựng của chủng probiotic đối với các sốc môi trường là hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu hiện tại, kết quả đã chứng minh L. plantarum VAL6 có khả năng sống sót ở các điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH axit rất thấp (pH 2,5), nhiệt độ cao 47oC và điều kiện yếm khí do CO2 tạo ra. Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng L. plantarum VAL6 như một vi khuẩn probiotic.

Khả năng sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 

Để chứng minh vi khuẩn sau khi thích nghi với sốc môi trường có khả năng sống sót tốt hơn trong quá trình sấy đông khô, nghiên cứu đã so sánh tỷ lệ % sống sót sau sấy đông khô của vi khuẩn được gây sốc và không gây sốc. 

Kết quả cho thấy sốc pH cải thiện đáng kể tỷ lệ sống sót của L. plantarum VAL6 trong quá trình sấy đông khô (hình 5). Tỷ lệ sống sót sau đông khô của tế bào vi khuẩn được gây sốc tăng dần theo thời gian xử lý thích nghi và đạt cao nhất gần 28% đối với tế bào được thích nghi khoảng 7 giờ ở pH 3,5. Trong khi đó, tỷ lệ này chỉ đạt khoảng 0,01% ở tế bào vi khuẩn không được gây sốc. 

Hình 5. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 sau khi thích nghi với sốc pH.

Tương tự như sốc pH, sự thích nghi với sốc nhiệt cũng tăng cường đáng kể khả năng sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 (hình 6). Nhìn chung, thời gian thích nghi với sốc nhiệt độ càng lâu thì khả năng sống sót càng tăng. Tỷ lệ sống sót cao hơn khi tế bào được xử lý thích nghi với sốc nhiệt ở 47oC, dao động khoảng 8-10% sau 3-7 giờ xử lý. 

Hình 6. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 sau khi thích nghi với sốc nhiệt.

Cùng với sự gia tăng mật số, sự sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 được xử lý CO2 tăng dần theo thời gian sục khí (hình 7). Ở điều kiện 1 giờ sục CO2, tỷ lệ sống sót của vi khuẩn là 4,97%. Tỷ lệ này tiếp tục tăng và đạt hơn 25% ở điều kiện xử lý CO2 24 giờ (sục CO2 liên tục).

Hình 7. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 sau khi thích nghi với CO2.

Sự sống sót và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào khả năng cảm nhận và phản ứng của chúng với các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, khả năng cung cấp chất dinh dưỡng và mật số tế bào . Các điều kiện sốc môi trường có thể kích thích vi khuẩn tổng hợp nên những yếu tố kháng lại điều kiện môi trường bất lợi

Kết luận

Kết quả nghiên cứu đã chứng minh việc sử dụng sốc môi trường để kích thích tạo phản ứng thích nghi của tế bào trước khi sấy đông khô có thể giúp cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn. Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng sốc môi trường để làm tăng tỷ lệ sống sót của các chủng giống LAB khởi động cho các ứng dụng thực phẩm.

Tiềm năng probiotic của L. plantarum VAL6 được thể hiện qua khả năng sống sót ở các điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH axit rất thấp (pH 2,5), nhiệt độ cao 47oC và điều kiện yếm khí do CO2 tạo ra. Đặt biệt, nuôi cấy tăng cường CO2 kích thích làm tăng mật số của L. plantarum VAL6. Sự thích nghi với các sốc môi trường như nhiệt độ, pH và sự tăng nồng độ CO2 có thể cải thiện khả năng sống sót của L. plantarum VAL6. Tỷ lệ sống sót đạt cao nhất đối với các tế bào được thích nghi ở điều kiện sốc pH 3,5 khoảng 5 giờ (28%, cao hơn khoảng 2500 lần so với đối chứng).